Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions

名古屋大学 / 金沢大学理工学域数物科学系Kaiタンパク質の動的相互作用： KaiCのリン酸化状態に依存してKaiAとの相互作用が概日周期的に変動することを見出した(Phase Dependent Differential Affinity: PDDAと名付けた )。KaiCのリン酸化概日周期について、実験で得られたパラメーターを用いて数理シミュレイションを行い、PDDAが概日周期にどのような影響を及ぼすのかを調べた。PDDAが無い場合には、KaiAとKaiCの濃度比が変動すると概日周期が消失するのに対して、PDDAがある場合には概日周期が維持される濃度比が3倍程度大きくなった。このことから、PDDAは細胞内でのタンパク質濃度の揺らぎに対するKaiシステムの頑強性に寄与していることが明らかになった。また、温度制御下でKaiA-KaiCの相互作用を調べたところ、25-29℃の温度範囲では動的親和性に大きな変化は見られえず、30℃以上では、KaiAとKaiCの親和性が大きく変化することがわかった。プロテアソームα7ホモ14量体のα６による2ステップ解体過程：領域内共同研究としてプロテアソーム構成タンパク質α7ホモ14量体がα6により解体される過程を観察した。α7-14量体をアミノシランで化学修飾したマイカに強固に吸着させると14量体が自発的に7量体に分離する様子が見られた。さらに，α7-7量体リングの中心孔にα6サブユニットが結合・解離を繰り返し、時間経過とともにα6が中心孔に強固に結合することが分かった。また、積層した７量体リング間に隙間が経時的に生じ、そこにα6が結合する様子が観察された。これらのことから、α7-14量体のα6サブユニットによる解体は、リング積層間隙へのα6の結合と解離、７量体リング中心孔へのα6の強固な結合によるダブルリングの再生阻止の２段階の過程を経ていることを明らかにした。研究課題/領域番号:16H00758, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2018-03-3

Innovative nanoscience of supermolecular motor proteins working in biomembranes

金沢大学理工学域数物科学系前年度に高速AFMを用いてα_3β_3複合体でATP加水分解に伴うβサブユニットの構造変化を画像化することに成功した。本年度は、βサブユニットの構造変化の詳細を調べ協同性の有無を明らかにするための観察を中心に行った。SPMシミュレータを用いてα_3β_3複合体の結晶構造モデルからAFM画像を再構成した結果、ATP非存在下ではα_3β_3複合体リング構造のうちβはαより凹凸が高く観察されることが分かり、実際に観察されたAFM像と良く一致した。一方、AMP-PNP存在下で観察されたAFM像は、一つのβが開状態で残り二つのβが閉状態であることが分かり、3つのβに同時にヌクレオチドが結合しないことが示された。また、観察されたAFM像は、ATPアナログ結合時の結晶構造から再構成されたシミュレイション像と良く一致し、開状態のβは閉状態より凹凸が高くなることも分かった。3つのβの中で最も凹凸が高い位置を追跡することで構造変化の協同性の有無を調べたところ、βの構造変化は反時計回りに一方向に進んでいることが明らかになった。ATP濃度依存性を調べた結果、βの構造変化の頻度に明瞭なATP濃度依存性がみられ、バルクで計測されたATPase活性のレートに非常によく一致した。ATPase活性はγサブユニットがある場合よりも1/100以下の値で、かつバックステップも多くみられるが、以上の結果はγがなくてもα_3β_3複合体内でATP加水分解の協同性が存在することを示している。αあるいはβが欠損した場合、構造変化の頻度が下がり、方向性も消失することから、サブユニットの構造変化を介して協同性が発揮されていると考えられる。研究課題/領域番号:21023010, 研究期間(年度):2009 – 201

High-speed atomic force microscopy

The technology of high-speed atomic force microscopy (HS-AFM) has reached maturity. HS-AFM enables us to directly visualize the structure and dynamics of biological molecules in physiological solutions at subsecond to sub-100 ms temporal resolution. By this microscopy, dynamically acting molecules such as myosin V walking on an actin filament and bacteriorhodopsin in response to light are successfully visualized. Highresolution molecular movies reveal the dynamic behavior of molecules in action in great detail. Inferences no longer have to be made from static snapshots of molecular structures and from the dynamic behavior of optical markers attached to biomolecules. In this review, we first describe theoretical considerations for the highest possible imaging rate, then summarize techniques involved in HS-AFM and highlight recent imaging studies. Finally, we briefly discuss future challenges to explore. © 2012 The Japan Society of Applied Physics

Science on Function of Soft Molecular Systems by Cooperation of Theory and Experiment

金沢大学理工研究域数物科学系昨年度までに開発した高速AFMインタラクティブモードの応用研究を進めた。具体的には、インタラクティブモードによりクラミドモナス鞭毛の軸糸微小管を部分破壊し、それによる微小管の崩壊を観察することで、微小管内部の結合タンパク質が微小管の構造を安定化していることを明らかにした。また、超分子ポリマーの部分切断と再重合過程や酸化還元酵素であるペルオキシレドキシンの高分子複合体の構造解析に関する研究にも応用した。これらにより、インタラクティブモード高速AFMがタンパク質の分子動態の操作だけでなく、分子複合体の部分破壊を利用した堅さ計測や構造解析に利用できることがわかった。分子動態の観察によって分子の柔らかさと機能の関係を明らかにすべく、分子シャペロンClpBのイメージングを行った。ATPの結合と加水分解に依存したClpB六量体リング構造の柔軟な形状変化が観察された。様々な変異体解析により、六量体リング構造の切断と回復などのダイナミックな構造変化がClpBシャペロン機能に重要であることを明らかにした。研究課題/領域番号:26102515, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-3

High-speed atomic force microscopy for nano-visualization of dynamic biomolecular processes

金沢大学理工研究域数物科学系The atomic force microscope (AFM) has a unique capability of allowing the high-resolution imaging of biological samples on substratum surfaces in physiological solutions. Recent technological progress of AFM in biological research has resulted in remarkable improvements in both the imaging rate and the tip force acting on the sample. These improvements have enabled the direct visualization of dynamic structural changes and dynamic interactions occurring in individual biological macromolecules, which is currently not possible with other techniques. Therefore, high-speed AFM is expected to have a revolutionary impact on biological sciences. In addition, the recently achieved atomic-resolution in liquids will further expand the usefulness of AFM in biological research. In this article, we first describe the various capabilities required of AFM in biological sciences, which is followed by a detailed description of various devices and techniques developed for high-speed AFM and atomic-resolution in-liquid AFM. We then describe various imaging studies performed using our cutting-edge microscopes and their current capabilities as well as their limitations, and conclude by discussing the future prospects of AFM as an imaging tool in biological research. © 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved

Science on Function of Soft Molecular Systems by Cooperation of Theory and Experiment

金沢大学理工研究域数物科学系昨年度までに開発した高速AFMインタラクティブモードの応用研究を進めた。具体的には、インタラクティブモードによりクラミドモナス鞭毛の軸糸微小管を部分破壊し、それによる微小管の崩壊を観察することで、微小管内部の結合タンパク質が微小管の構造を安定化していることを明らかにした。また、超分子ポリマーの部分切断と再重合過程や酸化還元酵素であるペルオキシレドキシンの高分子複合体の構造解析に関する研究にも応用した。これらにより、インタラクティブモード高速AFMがタンパク質の分子動態の操作だけでなく、分子複合体の部分破壊を利用した堅さ計測や構造解析に利用できることがわかった。分子動態の観察によって分子の柔らかさと機能の関係を明らかにすべく、分子シャペロンClpBのイメージングを行った。ATPの結合と加水分解に依存したClpB六量体リング構造の柔軟な形状変化が観察された。様々な変異体解析により、六量体リング構造の切断と回復などのダイナミックな構造変化がClpBシャペロン機能に重要であることを明らかにした。研究課題/領域番号:26104514, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-3

生体分子近傍における水和構造のナノスケール探索

金沢大学理工研究域前年度に製作した高速フォースマッピング測定システムを用いてマイカ/純水界面での高速フォースカーブ計測を行った結果、高速でAFM画像撮影中に、任意のポイントで10ms程度のスピードでフォースカーブ計測が可能であることを確認できた。一方、AFM走査中にアモルファスカーボンで製作された探針先端の状態が容易に変化するために、水和殻に起因する振動力の検出を安定に行うことが困難であることが分かった。探針先端強化のために種々の検討を行った結果、電子ビーム照射によるカーボン探針製作のためのソースガスとしてナフタレンと真空ポンプオイルの混合物が有効であることが分かった。また、CVD法によるカーボンナノチューブ探針の成長も行い、高速AFM用カンチレバー先端へのカーボンナノチューブ探針の成長に成功した。前年度までに高速位相検出法を開発し高感度な力検出が可能になったが、位相検出ではタンパク質を含む試料系で安定な高速AFM測定を行うことが困難であることが分かった。そこで、カンチレバー振幅の高感度検出法の開発を新たに行った。これまで用いてきた高速振幅計測は半周期毎に振幅値を更新できるが、カンチレバー振動信号をピークホールドする手法であるため、ノイズが大きく高感度な力検出は困難であった。1周期毎にしか更新できないが、ノイズに強いフーリエ法で振幅値を求める方法を開発した。この方法では、振動周期に同期した成分のみ高速で検出できるために、カンチレバーの熱ゆらぎの影響を抑え振幅検出のS/N比の向上が期待できる。実際に溶液中条件で試験を行った結果、振幅検出の低周波揺らぎを抑えることに成功した。今後、これら新しく開発した探針及び高感度力検出法により安定な水和力マッピングを目指していく。研究課題/領域番号:17710095, 研究期間(年度):2005 – 2007出典：「生体分子近傍における水和構造のナノスケール探索」研究成果報告書　課題番号17710095（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17710095/)を加工して作

Video-rate high-speed atomic force microscopy for biological sciences

金沢大学理工研究域数物科学系The atomic force microscope (AFM) is unique in its capability to capture high-resolution images of biological samples in liquids. This capability becomes more valuable to biological sciences if AFM additionally acquires an ability of high-speed imaging. "Direct and real-time visualization" is a straightforward and powerful means of understanding biomolecular processes. With conventional AFM, it takes more than a minute to capture an image, while biomolecular processes generally occur on a millisecond timescale. In order to fill this large gap,various efforts have been carried out in the past decade. Here, we review these past efforts, describe the current state of the capability and limitations of our high-speed AFM, and discuss possibilities that may break the limitations, leading to an innovative high-speed bioAFM

膜タンパク質会合過程の高速AFMイメージング

金沢大学理工学域数物科学系1. バクテリオロドプシン(bR)の構造変化の観察 : 光吸収サイクルが野性型bRよりも遅いD96N変異体を試料として、緑色レーザー光照射時の光吸収に伴う構造変化の観察を行った。細胞質側では光照射に同期してAFMで観察されるモノマーの輝点が約0.7nm変化することがわかった。光励起された分子の寿命を解析した結果、AFMで観察された構造変化は、基底状態からN中間体への遷移時に発生すると考えられている、EFループの移動であることが分かった。一方、このような構造変化は細胞外側では観察されなかった。また、EFループの移動により隣り合ったbRトライマー内のモノマー同士が相互作用した結果、励起分子の寿命が変化することが分かり、従来から分光法により議論されてきた光吸収サイクルの協同性が構造変化に起因することを明らかにした。2. ロドプシンの会合状態の観察 : 高速AFMでロドプシンの高分解能な動態変化過程や生理過程を捉えるため、AFM観察に適したロドプシン試料の調整としてウシロドプシンの抽出及び天然脂質膜へ再構成を行った。その結果、再構成時の脂質割合や界面活性剤の割合などの条件を変える事で2次元結晶の結晶化度が変化する事が分かった。また、天然の円盤膜中に存在するロドプシンでも、4℃で長時間インキュベーションを行うと2次元結晶化し、ダイマー構造をとることが確認できた。3. ATPaseの回転観察の試み : リジン基で修飾したF1モーターを用いることで、アミノシランおよびグルタルアルデヒド処理したマイカに比較的容易に固定できることが分かった。F1のYサブユニットに標識としてストレプトアビジンを固定し、ATP加水分解による回転運動を観察することができた。しかしながら、AFM観察によりYサブユニットが容易に引き抜かれてしまうことも判明し、再現性よく回転観察を行うところまでは達しなかった。研究課題/領域番号:19042009, 研究期間(年度):2007 – 2008出典：「膜タンパク質会合過程の高速AFMイメージング」研究成果報告書　課題番号19042009（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-19042009/)を加工して作

Method of mechanical holding of cantilever chip for tip-scan high-speed atomic force microscope

In tip-scan atomic force microscopy (AFM) that scans a cantilever chip in the three dimensions, the chip body is held on the Z-scanner with a holder. However, this holding is not easy for high-speed (HS) AFM because the holder that should have a small mass has to be able to clamp the cantilever chip firmly without deteriorating the Z-scanner\u27s fast performance, and because repeated exchange of cantilever chips should not damage the Z-scanner. This is one of the reasons that tip-scan HS-AFM has not been established, despite its advantages over sample stage-scan HS-AFM. Here, we present a novel method of cantilever chip holding which meets all conditions required for tip-scan HS-AFM. The superior performance of this novel chip holding mechanism is demonstrated by imaging of the α3β3 subcomplex of F1-ATPase in dynamic action at ∼7 frames/s. © 2015 AIP Publishing LLC